تأكيد نتائج التسلسل: متى يلزم إجراء اختبار متعامد

سبب وجود التأكيد

تنشأ عيوب التسلسل من أخطاء PCR، وكيمياء التسلسل، ومشاكل المحاذاة في المناطق المتكررة أو الغنية بـ GC، وتلف الحمض النووي الناجم عن الفورمالين الذي يحاكي الطفرات الحقيقية. التأكيد بطريقة متعامدة لها أوضاع فشل مختلفة يقلل من معدل الإيجابية الخاطئة.

كان تسلسل سانجر هو الأسلوب التأكيدي التقليدي؛ قد تستخدم المختبرات اليوم أيضًا اختبار تسلسل الجيل التالي الثاني، أو تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي أو تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاص بالأليل.

ما هي المكالمات المؤكدة

يتم الإبلاغ بشكل متزايد عن المكالمات عالية الثقة، والمواضع المغطاة جيدًا مع جزء أليل عالي التباين ودعم قوي للقراءة، دون تأكيد منفصل، مدعومة ببيانات التحقق القوية.

يتم إعطاء الأولوية للمكالمات التي من المرجح أن تكون مصنوعات صناعية للتأكيد: جزء أليل متغير منخفض، تغطية منخفضة، بوليمر متجانس أو مناطق متكررة، مواقع معروفة معرضة للتصنيع، وأي نتيجة ستؤدي بشكل مباشر إلى اتخاذ قرار علاج رئيسي.

حدود سانجر

يحتوي تسلسل سانجر على حد اكتشاف يبلغ حوالي 15 إلى 20 بالمائة من جزء الأليل المتغير، لذلك لا يمكنه تأكيد المكالمات ذات المستوى المنخفض التي يمكن أن يقوم بها تسلسل الجيل التالي. بالنسبة لهؤلاء، هناك حاجة إلى طريقة متعامدة أكثر حساسية.

وبالتالي فإن الفشل في تأكيد مكالمة منخفضة المستوى بواسطة Sanger لا يعني بالضرورة أن المكالمة كانت خاطئة.

ما لا يثبت

التأكيد يوضح أن المتغير موجود بالفعل في الحمض النووي الذي تم تحليله. ولم يثبت أن المتغير جسدي وليس سلالة جرثومية، أو أنه نسيلي، أو أنه ذو معنى سريري.

تتطلب هذه الأسئلة اختبارًا عاديًا مقترنًا وتقييم الاستنساخ والتفسير مقابل قاعدة الأدلة.

ملاحظات التفسير

إذا أشار التقرير إلى أنه تم تأكيد مكالمة المفتاح بشكل متعامد، فإن ذلك يضيف الثقة في الدقة الفنية للمكالمة.

بالنسبة لاستدعاءات كسور الأليل ذات التباين المنخفض، اسأل عن طريقة التأكيد المستخدمة، حيث لا يستطيع Sanger حلها.

الوجبات السريعة الرئيسية

• ·يحمي التأكيد المتعامد من تسلسل المصنوعات اليدوية التي تحاكي الطفرات الحقيقية.
• ·يتم إعطاء الأولوية لمكالمات VAF المنخفضة والتغطية المنخفضة ومكالمات المنطقة المتكررة للتأكيد.
• ·لا يمكن لتسلسل سانجر تأكيد المتغيرات التي تقل عن 15 إلى 20 بالمائة تقريبًا من VAF.
• ·يثبت التأكيد الوجود، وليس الأصل الجسدي، أو الاستنساخ أو المعنى السريري.