Подтверждение результатов секвенирования: когда необходимо ортогональное тестирование

Почему существует подтверждение

Артефакты секвенирования возникают из-за ошибок ПЦР, химического процесса секвенирования, проблем выравнивания в повторяющихся или богатых GC областях, а также вызванного формалином повреждения ДНК, имитирующего настоящие мутации. Подтверждение ортогональным методом с различными видами отказов снижает процент ложноположительных результатов.

Секвенирование по Сэнгеру было традиционным подтверждающим методом; сегодня лаборатории могут также использовать второй анализ секвенирования следующего поколения, цифровую ПЦР или аллель-специфическую ПЦР.

Какие вызовы подтверждены

О вызовах с высокой степенью достоверности, хорошо покрытых позициях с высокой фракцией аллелей вариантов и сильной поддержкой чтения все чаще сообщается без отдельного подтверждения, что подтверждается надежными данными проверки.

Вызовы, которые с большей вероятностью являются артефактами, имеют приоритет для подтверждения: низкая фракция аллелей вариантов, низкий охват, области гомополимера или повторов, известные позиции, склонные к артефактам, и любой результат, который непосредственно будет влиять на важное решение о лечении.

The Limits of Sanger

Секвенирование по Сэнгеру имеет предел обнаружения примерно от 15 до 20 процентов вариантов аллельной фракции, поэтому оно не может подтвердить низкоуровневые вызовы, которые может выполнить секвенирование следующего поколения. Для этого необходим более чувствительный ортогональный метод.

Таким образом, неспособность подтвердить вызов низкого уровня со стороны Сэнгера не обязательно означает, что вызов был неправильным.

Что не доказывает подтверждение

Подтверждение показывает, что вариант действительно присутствует в анализируемой ДНК. Он не устанавливает, что этот вариант является соматическим, а не зародышевым, является ли он клональным или имеет клиническое значение.

Эти вопросы требуют парного нормального тестирования, оценки клональности и интерпретации на основе доказательной базы.

Примечания по интерпретации

Если в отчете отмечается, что вызов ключа был ортогонально подтвержден, это добавляет уверенности в технической точности вызова.

Для вызовов фракций аллелей с низким вариантом спросите, какой метод подтверждения использовался, поскольку Сэнгер не может их разрешить.

Ключевые выводы

• ·Ортогональное подтверждение защищает от артефактов секвенирования, которые имитируют реальные мутации.
• ·Вызовы с низким VAF, низким покрытием и повторным регионом имеют приоритет для подтверждения.
• ·Секвенирование по Сэнгеру не может подтвердить варианты с содержанием VAF ниже примерно 15-20 процентов.
• ·Подтверждение доказывает наличие, а не соматическое происхождение, клональность или клиническое значение.