Confirmation des résultats de séquençage : quand un test orthogonal est-il nécessaire

Pourquoi la confirmation existe

Les artefacts de séquençage proviennent d'erreurs de PCR, de la chimie du séquençage, de problèmes d'alignement dans des régions répétitives ou riches en GC et de dommages à l'ADN induits par le formol qui imitent de véritables mutations. La confirmation par une méthode orthogonale comportant différents modes de défaillance réduit le taux de faux positifs.

Le séquençage de Sanger était la méthode de confirmation traditionnelle ; aujourd'hui, les laboratoires peuvent également utiliser un deuxième test de séquençage de nouvelle génération, la PCR numérique ou la PCR allèle spécifique.

Quels appels sont confirmés

Les appels à haute confiance, les positions bien couvertes avec une fraction d'allèle variante élevée et un fort support de lecture, sont de plus en plus signalés sans confirmation séparée, étayés par des données de validation robustes.

Les appels les plus susceptibles d'être des artefacts sont prioritaires pour confirmation : faible fraction d'allèle variant, faible couverture, régions homopolymères ou répétées, positions connues sujettes aux artefacts et tout résultat qui déterminera directement une décision de traitement majeure.

Les limites de Sanger

Le séquençage de Sanger a une limite de détection d’environ 15 à 20 % de fraction d’allèle variant, il ne peut donc pas confirmer les appels de bas niveau que le séquençage de nouvelle génération peut effectuer. Pour ceux-là, une méthode orthogonale plus sensible est nécessaire.

L'incapacité de Sanger à confirmer un appel de bas niveau ne signifie donc pas nécessairement que l'appel était erroné.

Ce que la confirmation ne prouve pas

La confirmation montre que le variant est bien présent dans l'ADN analysé. Il n’établit pas que la variante est somatique plutôt que germinale, qu’elle est clonale ou qu’elle est cliniquement significative.

Ces questions nécessitent des tests normaux couplés, une évaluation de la clonalité et une interprétation par rapport à la base de preuves.

Notes d'interprétation

Si un rapport indique qu'un appel clé a été confirmé orthogonalement, cela renforce la confiance dans l'exactitude technique de l'appel.

Pour les appels de fractions alléliques variantes faibles, demandez quelle méthode de confirmation a été utilisée, puisque Sanger ne peut pas les résoudre.

Points clés à retenir

• ·La confirmation orthogonale protège contre les artefacts de séquençage qui imitent des mutations réelles.
• ·Les appels à faible VAF, à faible couverture et à région répétée sont prioritaires pour la confirmation.
• ·Le séquençage de Sanger ne peut pas confirmer les variantes inférieures à environ 15 à 20 % de VAF.
• ·La confirmation prouve la présence, et non l'origine somatique, la clonalité ou la signification clinique.