Mengonfirmasi Hasil Urutan: Kapan Pengujian Ortogonal Diperlukan

Mengapa Konfirmasi Ada

Artefak pengurutan muncul dari kesalahan PCR, pengurutan kimia, masalah penyelarasan di wilayah berulang atau kaya GC, dan kerusakan DNA akibat formalin yang meniru mutasi sebenarnya. Konfirmasi dengan metode ortogonal yang memiliki mode kegagalan berbeda mengurangi tingkat positif palsu.

Pengurutan sanger adalah metode konfirmasi tradisional; laboratorium saat ini juga dapat menggunakan uji sekuensing generasi kedua, PCR digital, atau PCR spesifik alel.

Panggilan Mana yang Dikonfirmasi

Panggilan berkeyakinan tinggi, posisi tercakup dengan baik dengan fraksi alel varian tinggi dan dukungan baca yang kuat, semakin banyak dilaporkan tanpa konfirmasi terpisah, didukung oleh data validasi yang kuat.

Panggilan yang lebih mungkin merupakan artefak diprioritaskan untuk konfirmasi: fraksi alel varian rendah, cakupan rendah, daerah homopolimer atau berulang, posisi rawan artefak yang diketahui, dan hasil apa pun yang secara langsung akan mendorong keputusan pengobatan yang besar.

Batasan Sanger

Pengurutan Sanger memiliki batas deteksi sekitar 15 hingga 20 persen varian fraksi alel, sehingga tidak dapat mengonfirmasi panggilan tingkat rendah yang dapat dilakukan oleh pengurutan generasi berikutnya. Untuk itu, diperlukan metode ortogonal yang lebih sensitif.

Oleh karena itu, kegagalan Sanger untuk mengonfirmasi panggilan tingkat rendah tidak selalu berarti panggilan tersebut salah.

Yang Konfirmasinya Tidak Terbukti

Konfirmasi menunjukkan varian tersebut benar-benar ada dalam DNA yang dianalisis. Hal ini tidak menetapkan bahwa varian tersebut bersifat somatik, bukan germline, bersifat klonal, atau bermakna secara klinis.

Pertanyaan-pertanyaan tersebut memerlukan pengujian normal berpasangan, penilaian klonalitas, dan interpretasi terhadap basis bukti.

Catatan Interpretasi

Jika sebuah laporan mencatat bahwa panggilan kunci dikonfirmasi secara ortogonal, hal itu menambah keyakinan pada keakuratan teknis panggilan tersebut.

Untuk panggilan fraksi alel varian rendah, tanyakan metode konfirmasi apa yang digunakan, karena Sanger tidak dapat menyelesaikannya.

Poin Penting

• ·Konfirmasi ortogonal melindungi terhadap pengurutan artefak yang meniru mutasi nyata.
• ·Panggilan dengan VAF rendah, jangkauan rendah, dan wilayah berulang diprioritaskan untuk konfirmasi.
• ·Pengurutan Sanger tidak dapat memastikan varian di bawah sekitar 15 hingga 20 persen VAF.
• ·Konfirmasi membuktikan keberadaan, bukan asal somatik, klonalitas, atau makna klinis.