Confirmando Resultados de Sequenciamento: Quando o Teste Ortogonal é Necessário

Por que existe a confirmação

Artefatos de sequenciamento surgem de erros de PCR, química de sequenciamento, problemas de alinhamento em regiões repetitivas ou ricas em GC e danos ao DNA induzidos por formalina que imitam mutações reais. A confirmação por um método ortogonal que possui diferentes modos de falha reduz a taxa de falsos positivos.

O sequenciamento Sanger foi o método confirmatório tradicional; hoje os laboratórios também podem usar um ensaio de sequenciamento de segunda geração, PCR digital ou PCR específico de alelo.

Quais chamadas estão confirmadas

Chamadas de alta confiança, posições bem cobertas com uma alta fração de alelos variantes e forte suporte de leitura, são cada vez mais relatadas sem confirmação separada, apoiadas por dados de validação robustos.

Chamadas que são mais prováveis de serem artefatos são priorizadas para confirmação: fração de alelo variante baixa, baixa cobertura, homopolímero ou regiões repetidas, posições conhecidas propensas a artefatos e qualquer resultado que conduzirá diretamente a uma decisão de tratamento importante.

Os Limites de Sanger

O sequenciamento Sanger tem um limite de detecção de aproximadamente 15 a 20 por cento de fração de alelo variante, portanto, não pode confirmar chamadas de baixo nível que o sequenciamento de próxima geração pode fazer. Para estes, é necessário um método ortogonal mais sensível.

Uma falha na confirmação de uma chamada de baixo nível por parte da Sanger, portanto, não significa necessariamente que a chamada estava errada.

O que a confirmação não prova

A confirmação mostra que a variante está realmente presente no DNA analisado. Não estabelece que a variante seja somática e não germinativa, que seja clonal ou que seja clinicamente significativa.

Essas questões requerem testes normais pareados, avaliação de clonalidade e interpretação em relação à base de evidências.

Notas de Interpretação

Se um relatório observar que uma chamada principal foi confirmada ortogonalmente, isso aumenta a confiança na precisão técnica da chamada.

Para chamadas de fração alélica de variante baixa, perguntar qual método de confirmação foi utilizado, uma vez que Sanger não pode resolvê-las.

Principais conclusões

• ·A confirmação ortogonal protege contra artefatos de sequenciamento que imitam mutações reais.
• ·Chamadas de baixo VAF, baixa cobertura e regiões repetidas são priorizadas para confirmação.
• ·O sequenciamento Sanger não pode confirmar variantes abaixo de aproximadamente 15 a 20 por cento de VAF.
• ·A confirmação comprova presença, e não origem somática, clonalidade ou significado clínico.