Тестирование слияния генов: FISH, иммуногистохимия, секвенирование ДНК и РНК

Флуоресцентная гибридизация in-situ

В методе FISH с разделением на части используются два цветных зонда, фланкирующих ген. Когда ген не поврежден, цвета перекрываются; когда его переставляют, они разделяются. Он обнаруживает, что произошел разрыв, без идентификации партнера.

FISH может пропустить небольшие внутрихромосомные перестройки, при которых зонды едва разделяются, и это требует интерпретации заданного количества ядер относительно порогового значения.

Иммуногистохимия

Иммуногистохимия обнаруживает аномальную экспрессию слитого белка, например белка ALK, который обычно отсутствует в легочной ткани. Он быстрый, дешевый и работает с небольшими образцами, что делает его хорошим экраном.

Специфичность варьируется в зависимости от цели: она высока для ALK, но ниже для ROS1 и NTRK, поэтому положительные результаты для них часто требуют подтверждения.

Секвенирование на основе ДНК

Секвенирование ДНК следующего поколения может обнаружить слияния, если оно охватывает области интронных точек разрыва. Трудность состоит в том, что точки останова часто попадают в очень большие или повторяющиеся интроны, которые трудно выделить с помощью зондов, поэтому некоторые слияния пропускаются.

Панели ДНК хороши в отношении точечных мутаций и количества копий, поэтому широко распространен комбинированный подход.

Секвенирование на основе РНК

Секвенирование РНК считывает сплайсированный транскрипт, где место слияния представляет собой единственную чистую границу между экзонами, независимо от того, в каком месте интрона произошел разрыв ДНК. Это делает его хорошо подходящим для обнаружения слияний и идентификации партнера и варианта.

Для этого требуется РНК хорошего качества, количество которого может быть ограничено в старых или плохо сохранившихся образцах, а данные проверки квалификации показывают, что эффективность варьируется в зависимости от лаборатории.

Примечания по интерпретации

Отрицательный результат слияния следует сравнивать с используемым методом: панель ДНК с ограниченным покрытием интронов или только иммуногистохимия не исключают слияние с такой же уверенностью, как секвенирование РНК.

Когда целенаправленное слияние сильно ожидается, но не обнаружено, разумным является тестирование ортогональным методом.

Ключевые выводы

• ·FISH обнаруживает, что произошел разрыв, но не партнер; небольшие перестановки могут быть пропущены.
• ·Иммуногистохимия является хорошим методом скрининга с различной специфичностью в зависимости от цели.
• ·Секвенирование ДНК может пропустить слияния с точками разрыва в больших интронах.
• ·Секвенирование РНК считывает чистое соединение слияния и часто является предпочтительным методом подтверждения.