Confirmación de los resultados de la secuenciación: ¿Cuándo se necesitan pruebas ortogonales?
La secuenciación de próxima generación produce millones de lecturas y, con ellas, una pequeña tasa de artefactos técnicos. Los laboratorios confirman las llamadas de variantes seleccionadas mediante un método independiente, históricamente la secuenciación de Sanger, para protegerse contra falsos positivos. Saber qué llamadas están confirmadas aclara cuánto peso darles.
Respuesta Rápida
La secuenciación de próxima generación produce millones de lecturas y, con ellas, una pequeña tasa de artefactos técnicos. Los laboratorios confirman las llamadas de variantes seleccionadas mediante un método independiente, históricamente la secuenciación de Sanger, para protegerse contra falsos positivos. Saber qué llamadas están confirmadas aclara cuánto peso darles.
Por qué existe la confirmación
Los artefactos de secuenciación surgen de errores de PCR, química de secuenciación, problemas de alineación en regiones repetitivas o ricas en GC y daños en el ADN inducidos por formalina que imitan mutaciones reales. La confirmación mediante un método ortogonal que tiene diferentes modos de falla reduce la tasa de falsos positivos.
La secuenciación de Sanger fue el método de confirmación tradicional; Hoy en día, los laboratorios también pueden utilizar un segundo ensayo de secuenciación de próxima generación, una PCR digital o una PCR específica de alelo.
Qué llamadas se confirman
Las llamadas de alta confianza, las posiciones bien cubiertas con una alta fracción de alelos variantes y un fuerte soporte de lectura se informan cada vez más sin confirmación por separado, respaldada por datos de validación sólidos.
Se priorizan para la confirmación las llamadas que tienen más probabilidades de ser artefactos: fracción alélica variante baja, cobertura baja, regiones de homopolímero o repetición, posiciones conocidas propensas a artefactos y cualquier resultado que impulse directamente una decisión de tratamiento importante.
Los límites de Sanger
La secuenciación de Sanger tiene un límite de detección de aproximadamente del 15 al 20 por ciento de la fracción de alelo variante, por lo que no puede confirmar las llamadas de bajo nivel que puede realizar la secuenciación de próxima generación. Para ello, se necesita un método ortogonal más sensible.
Por lo tanto, el hecho de que Sanger no confirme una llamada de bajo nivel no significa necesariamente que la llamada haya sido incorrecta.
Lo que la confirmación no prueba
La confirmación muestra que la variante está realmente presente en el ADN analizado. No establece que la variante sea somática y no germinal, que sea clonal o que tenga significado clínico.
Esas preguntas requieren pruebas normales pareadas, evaluación de clonalidad e interpretación frente a la base de evidencia.
Notas de interpretación
Si un informe señala que una llamada clave fue confirmada ortogonalmente, eso agrega confianza en la precisión técnica de la llamada.
Para llamadas de fracciones de alelos de variantes bajas, pregunte qué método de confirmación se utilizó, ya que Sanger no puede resolverlas.
Conclusiones clave
- ·La confirmación ortogonal protege contra artefactos de secuenciación que imitan mutaciones reales.
- ·Las llamadas de VAF bajo, de baja cobertura y de regiones repetidas tienen prioridad para la confirmación.
- ·La secuenciación de Sanger no puede confirmar variantes por debajo de aproximadamente el 15 al 20 por ciento de VAF.
- ·La confirmación prueba la presencia, no el origen somático, la clonalidad o el significado clínico.
Poner estos genes en el contexto de la vía.
Preguntas frecuentes
¿Cuál es la idea clave en Confirmación de los resultados de la secuenciación: ¿Cuándo se necesitan pruebas ortogonales?
La secuenciación de próxima generación produce millones de lecturas y, con ellas, una pequeña tasa de artefactos técnicos. Los laboratorios confirman las llamadas de variantes seleccionadas mediante un método independiente, históricamente la secuenciación de Sanger, para protegerse contra falsos positivos. Saber qué llamadas están confirmadas aclara cuánto peso darles.
¿Qué se debe conservar con el resultado o mecanismo?
Las llamadas de baja VAF, baja cobertura y regiones repetidas tienen prioridad para la confirmación. La secuenciación de Sanger no puede confirmar variantes por debajo de aproximadamente el 15 al 20 por ciento de VAF. La confirmación prueba la presencia, no el origen somático, la clonalidad o el significado clínico.
Referencias
- 1Directrices para la validación de paneles oncológicos basados en secuenciación de próxima generación. Revista de Diagnóstico Molecular, 2017. PubMed
- 2Paneles de mutación somática: es hora de limpiar sus nombres. Genética del cáncer, 2019. PubMed
- 3Guía de pruebas moleculares actualizada para la selección de pacientes con cáncer de pulmón para tratamiento con inhibidores de tirosina quinasa específicos. Archivos de Patología y Medicina de Laboratorio, 2018. PubMed
- 4Secuenciación de ARN para la detección de genes de fusión de tumores sólidos: práctica y rendimiento de pruebas de competencia. Archivos de Patología y Medicina de Laboratorio, 2024. PubMed
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