Teste de fusão genética: FISH, imunohistoquímica, sequenciamento de DNA e RNA

Hibridação in-situ por fluorescência

Break-apart FISH usa duas sondas coloridas flanqueando um gene. Quando o gene está intacto, as cores se sobrepõem; quando é reorganizado, eles se separam. Ele detecta que ocorreu uma ruptura sem identificar o parceiro.

O FISH pode perder pequenos rearranjos intracromossômicos onde as sondas mal se separam e requer a interpretação de um determinado número de núcleos contra um corte.

Imunohistoquímica

A imuno-histoquímica detecta expressão anormal da proteína de fusão, por exemplo, proteína ALK que está normalmente ausente no tecido pulmonar. É rápido, barato e funciona em amostras pequenas, o que o torna uma boa tela.

A especificidade varia de acordo com o alvo: é alta para ALK, mas menor para ROS1 e NTRK, portanto, resultados positivos para estes geralmente precisam de confirmação.

Sequenciamento Baseado em DNA

O sequenciamento de DNA de próxima geração pode detectar fusões se cobrir as regiões de ponto de quebra intrônico. A dificuldade é que os pontos de interrupção geralmente ocorrem em íntrons muito grandes ou repetitivos que são difíceis de agrupar com sondas, de modo que algumas fusões são perdidas.

Painéis de DNA são bons em mutações pontuais e número de cópias, portanto, uma abordagem combinada é comum.

Sequenciamento Baseado em RNA

O sequenciamento de RNA lê o transcrito emendado, onde a junção de fusão é um único limite limpo de éxon a éxon, independentemente de onde nos íntrons ocorreu a quebra de DNA. Isto o torna adequado para detectar fusões e identificar o parceiro e a variante.

Requer RNA de boa qualidade, que pode ser limitado em amostras mais antigas ou mal preservadas, e os dados de testes de proficiência mostram que o desempenho varia entre os laboratórios.

Notas de Interpretação

Um resultado de fusão negativo deve ser lido em relação ao método utilizado: um painel de DNA com cobertura intrônica limitada, ou apenas imuno-histoquímica, não exclui uma fusão com tanta segurança quanto o sequenciamento de RNA.

Quando uma fusão alvo é fortemente esperada, mas não encontrada, o teste por um método ortogonal é razoável.

Principais conclusões

• ·FISH detecta que ocorreu uma ruptura, mas não o parceiro; pequenos rearranjos podem ser perdidos.
• ·A imunohistoquímica é uma boa triagem, com especificidade variável por alvo.
• ·O sequenciamento de DNA pode perder fusões com pontos de quebra em íntrons grandes.
• ·O sequenciamento de RNA lê a junção de fusão limpa e é frequentemente o método de confirmação preferido.