确认测序结果：何时需要正交测试

为什么存在确认

测序伪影源自 PCR 错误、测序化学、重复或富含 GC 区域的比对问题，以及模拟真实突变的福尔马林诱导的 DNA 损伤。通过具有不同故障模式的正交方法进行确认可降低误报率。

桑格测序是传统的验证方法；如今，实验室还可以使用第二种下一代测序测定、数字 PCR 或等位基因特异性 PCR。

哪些呼叫已确认

越来越多地报告高置信度调用、具有高变异等位基因分数和强大读取支持的良好覆盖位置，而无需单独确认，并得到可靠的验证数据的支持。

更可能是伪影的调用优先进行确认：低变异等位基因分数、低覆盖率、同聚物或重复区域、已知的伪影倾向位置以及将直接推动主要治疗决策的任何结果。

桑格的局限性

Sanger 测序的检测限约为 15% 至 20% 的变异等位基因分数，因此它无法确认下一代测序可以进行的低水平检测。对于这些，需要更灵敏的正交方法。

因此，未能确认 Sanger 的低级调用并不一定意味着该调用是错误的。

确认不能证明什么

确认表明该变体确实存在于分析的 DNA 中。它并没有确定该变异是体细胞的而不是种系的，它是克隆的，或者它具有临床意义。

这些问题需要配对正常测试、克隆性评估和针对证据基础的解释。

解释说明

如果报告指出关键调用已得到正交确认，则会增加对调用技术准确性的信心。

对于低变异等位基因分数调用，询问使用了什么确认方法，因为 Sanger 无法解析它们。

要点

• ·正交确认可防止模仿真实突变的测序假象。
• ·低 VAF、低覆盖率和重复区域的呼叫将优先进行确认。
• ·Sanger 测序无法确认 VAF 低于大约 15% 至 20% 的变异。
• ·确认证明存在，而不是体细胞起源、克隆性或临床意义。